راه اندازی روش pcr poly (a) -tailed universal reverse transcription برای تکثیر غیر وابسته به توالی روتا ویروس گاوی بازآرایی شده

چکیده گروه a روتاویروس بیشترین عامل مهم گاستروانتریت ویروسی انسان در جهان است، بنابراین تشخیص و درمان این بیماری از اهمیت ویژه ای برخوردار است. تصور بر این است که تغییرات آنتی ژنیک شیفت، دریفت و بازآرایی ژنومی درون یک قطعه، مکانیسم های تکاملی روتاویروس باشند. تکثیر متوالی ویروس با moi بالا در کشت سلول و همچنین عفونت های مزمن در گروه-های هدف با نقص ایمنی، در تکامل آن نقش دارد. از آنجا که مطالعات قطعات بازآرایی شده برای تشخیص توالی های ضروری برای تکثیر و بسته بندی مفید است، هدف از انجام مطالعه ی حاضر بررسی توانایی روشpoly(a)-tailed universal reverse transcription pcr در تشخیص قطعات استاندارد و بازآرایی شده است. با این هدف، راندمان تکثیر با این روش، برای تکثیر سویه ی rf از روتاویروس گاوی بررسی شد. ما توانایی روش poly(a)-rt-pcr پس از page و رنگ آمیزی نیترات نقره را برای ردیابی ویژه دو قطعه ی بازآرایی شده ارزیابی نمودیم. برای استفاده از این روش روتاویروس روی رده ی سلولی ma-104 متراکم تک لایه ای با moi یک، کشت داده شد و هر پاساژ برای بررسی بیشتر پروفایل های ژنومی توسط ژل پلی آکریل آمید 10 درصد به مقادیرمورد استفاده تقسیم و فریز شد. ژنوم rna دو رشته ای استخراج و توسط پلی آدنیلاسیون دم پلی آ در انتهای 3^ ژنوم هدف تک رشته ای افزوده شد و سپسrna برچسب دار برای تکثیر و ردیابی قطعات استاندارد و بازآرایی شده روتاویروس سویه یrf استاندارد و بازآرایی شده با استفاده از rt-pcr استفاده شد. cdna توسط آغازگر طراحی شده از zebra fish و بدون استفاده از آغازگرهای از قبل طراحی شده تولید شد. به منظور تایید امکان این رهیافت، rt-pcr با آغازگرهای اختصاصی و ژنوم اصلاح نشده نیزانجام شد. نتایج، بازآرایی ژن از طریق پاساژهای سریالی روتاویروس را نشان داد، که طی آن ژن های nsp1وnsp3 با الگوی مهاجرت متفاوت در الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید و در زمینه ای ازهمتاهای استاندارد مشاهده شدند. بر خلاف قطعات استاندارد تکثیر ضعیف قطعات بازآرایی شده بیش از همتایان استاندارد خود نشان داده شد، که شاید به دلیل توالی کوتاه در قطعات استاندارد باشد. نتایج تاکید می کند که rt-pcr نسبت به انواع بازآرایی شده تمایل به تکثیر الگوهای کوتاه دارد و نمی تواند برای ردیابی توالی های بازآرایی شده در زمینه ای ازتوالی های همولوگ استاندارد استفاده شود، بنابراین poly(a)-rt-pcr توسعه یافت. در این مطالعه یک دستورالعمل جدید برای تولید cdna با طول کامل از rna های غیر آدنیله (بدون دم پلی آ) برای روتاویروس معرفی شده است. مشکلات بالقوه در طی مطالعه نشان می دهد که احتمالا متابولیت هایی در طی تکثیر روتا ویروس تولید می شود که به پلی آدنیلاسیون مقاومت نشان می دهد، که اثبات آن نیاز به مطالعه بیشتر دارد. کلمات کلیدی: تکثیر، گاستروانتریت، poly(a)rt-pcr، بازآرایی، روتاویروس.